Laboratoř molekulární patologie

Metoda kvantitativní fluorescenční PCR (QF-PCR) – tzv. AmnioPCR umožňuje, ze vzorku plodové vody, rychlou (do 24-48 hodin) detekci nejčastějších změn počtu chromosomů 13, 18, 21, X a Y (Downův syndrom, Edwardsův syndrom, Patauův syndrom) a určení pohlaví s nízkým rizikem falešné pozitivity/negativity. Početní změny výše uvedených chromosomů tvoří většinu numerických chromosomálních aberací, zjišťovaných u plodu (cca 75 % prenatálně detekovaných chromosomálních aberací). Následně je nález potvrzen komplexním vyšetření všech chromosomů pomocí klasické cytogenetické analýzy, která trvá zhruba 2 – 3 týdny od odběru plodové vody. Tato analýza umožňuje zjistit případné další změny, které pomocí AmnioPCR nelze stanovit.

Materiál pro vyšetření:

• 15ml plodové vody do sterilní nádobky označené štítkem se jménem a datem narození pacientky
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientce a informovaný souhlas pacientky s požadovaným vyšetřením.

Metoda detekce:

Z odebraného vzorku plodové vody je na počátku provedena izolace DNA (z buněk, přítomných v plodové vodě – nekultivovaných amniocytů). Následně je provedena analýza chromosomů 13, 18, 21, X a Y pomocí kitu Aneufast TM QF-PCR (Genomed Ltd).

Transport vzorků do laboratoře – zajištěn svozem CGB laboratoře a.s.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 24-48 hodin po převzetí vzorku plodové vody
• výsledek je ihned po uzavření vyšetření telefonicky sdělen pacientce (po ověření totožnosti)
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Celiakální sprue (CS) (OMIM 212750) je multifaktoriální onemocnění, charakterizované celoživotní abnormální imunitní odpovědí, které vykazuje autoimunní rysy na lepek - způsobující u geneticky vnímavých jedinců morfologické změny na střevní sliznici. Porovnání laboratorních výsledků a klinických příznaků ukazují, že exprese CS je velmi heterogenní a že zánětlivé změny sliznice tenkého střeva a jejich tíže jsou velmi variabilní. CS je časté onemocnění a jeho frekvence se udává mezi 1/200 až 1/300 jedinců, s tím, že střevní symptomatologie se objevuje jen v 10 – 20% případů.
Onemocnění má velmi úzký vztah k HLA genům II. třídy, které jsou lokalizovány na šestém chromosomu, v oblasti 6p21.3. Uvádí se, že více než 90 % nemocných s CS nese heterodimer HLA-DQ2 (kódován alelami HLA-DQA1*05 a DQB1*0201/202) a přibližně 5-10% pacientů nese heterodimer HLA-DQ8 (kódován alelami HLA-DQA1*03 a DQB1*0302 a uvádí se, že ty jsou v těsné vazbě s alelou DRB1*04). Uvedené alely se vyskytují přibližně u 20-30% zdravé bělošské populace. Molekulárně genetické vyšetření prováděné v naší laboratoři je zaměřeno na detekci těchto rizikových alel. Kombinace klinických pozorování, imunologických a molekulárně genetických metod umožňuje potvrdit diagnózu, zachytit rizikové jedince v rodinách pacientů na základě jejich genotypů a připravit rodiny na potřebné klinické a dietetické opatření.

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• případně zamražené střevní biopsie
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Metoda detekce HLA alel II. třídy:

PCR se sekvenčně specifickými primery. Použitými primery nelze přesně určit, která konkrétní alela z daného lokusu je v genomu přítomna. Použitou metodou nelze rozlišit, zda jsou alely v heterozygotním nebo homozygotním stavu a zda jsou v pozici cis nebo trans.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření

Crohnova choroba (CD, OMIM 266600) je nespecifické zánětlivé onemocnění trávicího traktu, postihující nejčastěji oblast tenkého a tlustého střeva (často konečnou část tenkého střeva – ileum), postiženy však mohou být prakticky jakékoliv úseky trávicí trubice. Zánět postihuje střevo do hloubky v celé šířce střevní stěny, segmentárně a je zde sklon ke tvorbě píštělí a abscesů. Nemoc se projevuje průjmy, bolestmi břicha, poruchou trávení a vstřebávání (malabsorpcí), celkovými příznaky (zvýšenou teplotou aj.) a příznaky mimostřevními (bolestmi a záněty kloubů, aftózní stomatitidou a jinými kožními obtížemi).
Příčina Crohnovy choroby není dosud přesně známa. Sklon k onemocnění je ovlivněn geneticky a nemoc může být v náchylné osobě vyvolána vlivy okolního prostředí (dietní chyby, kouření, stres). Rovněž se na rozvoji onemocnění uplatňují faktory imunologické a infekční (vše je předmětem intenzivního výzkumu). V nedávné době bylo identifikováno několik chromosomových oblastí, které vykazují možnou spojitost s náchylností ke vzniku Crohnovy choroby (např. na chromosomu 5p13.1, 6p21).
Jedním z významných genů, jehož mutace jsou asociovány se zvýšenou pravděpodobností rozvoje Crohnovy choroby, patří gen NOD2/CARD15, který se nachází na chromosomu 16q12. Protein kódovaný tímto genem hraje důležitou roli v imunitní odpovědi na bakteriální infekci. Mutace v tomto genu mají za následek změnu funkce proteinu, které vedou ve svém důsledku ke ztrátě kontroly organismu na bakteriální infekci. Tři mutace v NOD2/CARD15 genu (R702W, G908R, 3020insC) představují přibližně až 82 % mutací u pacientů s Crohnovou chorobou. Uvádí se, že relativní riziko rozvoje CD je 2-4x vyšší u nosičů jedné mutace (heterozygoti) a až 17x vyšší u nosičů dvou mutací (homozygoti, složení heterozygoti). Uvádí se, že mutace v NOD2/CARD15 genu se vyskytují přibližně u 7-20 % zdravé populace a 30-50 % pacientů s CD.

Vyšetřované mutace v NOD2/CARD15 genu:

• R702W (c.2104C>T)
• G908R (c.2722G>C)
• 3020insC (1007fs) (c.3019_3020insC)

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Metoda detekce mutací:

PCR a následné štěpení pomocí restrikčních enzymů (PCR-RFLP).

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Cystická fibróza (CF; OMIM 219 700) je jedním z nejčastějších geneticky podmíněných onemocnění, které postihuje dýchací a zažívací systém osob obou pohlaví. Je chronickým onemocněním, které vyžaduje trvalou a odbornou léčbu. Projevy a závažnost cystické fibrózy se u jednotlivých pacientů liší. Závažnost je charakterizována opakovanými záněty plic, pankreatickou nedostatečností a mužskou neplodností. Přes veškerou péči má s rostoucím věkem tendenci se zhoršovat.

Cystická fibróza je autozomálně recesivní poruchou (onemocnění vzniká zděděním obou alel nesoucích mutace v CFTR genu) s frekvencí 1: 2500 novorozenců. CFTR protein se účastní transmembránového přenosu iontů mezi vnitřním a vnějším prostředím buněk. Osoby nesoucí mutaci pouze na jedné alele jsou nepostiženými přenašeči – heterozygoty. Frekvence výskytu heterozygotů v naší populaci se uvádí 1 : 25. Možnost přenašečství mutace v CFTR genu významně stoupá, pokud byla přítomnost mutace v příbuzenstvu již prokázána. Z těchto důvodů se doporučuje u všech zdravých příbuzných pacienta vyšetřit mutace genu pro CF. Při zjištění přenašečství se doporučuje rovněž vyšetření partnera, zda není nosičem známých mutací.

Indikace vyšetření:

1. u pacienta s příznaky cystické fibrózy
2. u příbuzných pacienta s cystickou fibrózou a detekovanými mutacemi v CFTR genu
3. u partnera nosiče mutace před plánovaným těhotenstvím, případně v průběhu těhotenství
4. u dospělých mužů s poruchou plodnosti
5. prenatální diagnostika v případě obou partnerů heterozygotů pro mutaci v CFTR genu.

Vyšetřované mutace v CFTR genu:

• F508del, CFTRdele2.3/21kb, G551D, N1303K, G542X, 1898+1G→A, R347P, W1282X, 1717-1 G→A, R553X, (2143delT, R347P, 3849+10kbC→T, R1162X, G85E, R117H, 621+1G→T, R334W, 2183AA→G, 2789+5G→A, 3659delC)
• 711+1G→T, 3272-26A→G, I148T, 3199delG, 3120+1G→A, S1251N, 3905insT, R560T, I507del, Q552X, (394delTT, 1078delT, A455E, E60X, 2184delA, 711+5G→A, Tn varianty)

Těchto 20 (36) mutací představuje výskyt u 87,42 %, resp. 90,6 % pacientů s CF v české populaci.

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)

Dokumentace:

• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Metoda detekce mutací:

• provádíme identifikaci 20 mutací (případně rozšířenou na 36 mutací + Tn varianty)
• principem detekce 19 (36) mutací je multiplex polymerázová řetězová reakce (PCR) s následnou reverzní hybridizací a v případě 1 mutace se používá metoda RFLP
• k detekci je použit kit INNO-LiPA CFTR 19 / INNO-LiPA 17+Tn Update (INNOGENETICS).

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Do nedávné doby byla standardní léčbou glioblastomu multiforme kombinace maximálně možné resekce a radioterapie. V poslední době v souladu s pokroky v poznání kancerogeneze se užívá kombinace resekce, radioterapie a chemoterapie alkylačními činidly (temozolomid, TMZ). Temozolomid je alkylační činidlo, které ve fyziologickém prostředí spontánně konvertuje na aktivní metabolit a tento indukuje alkylaci DNA na pozici O6guaninu. Temozolomid se dobře vstřebává a poměrně snadno prochází blood-brain bariérou. Temozolomid tvoří adukty v DNA, které jsou následně rozpoznávány a opravovány reparačním enzymem O⁶– methylguanin- DNA methyltransferázou (MGMT). O⁶–methylguanin- DNA methyltransferáza (MGMT, OMIM 156569) je reparační enzym, který odstraňuje poškození DNA způsobené alkylačními činidly. Gen kódující tento enzym je lokalizován na chromosomu 10q26. Tento enzym přenáší metylovou skupinu z O⁶ guaninu na reziduum cysteinu v akceptorové doméně enzymu. Takto dochází k ireverzibilní inaktivaci enzymu a k indukci nové syntézy MGMT. Metylací promotoru MGMT genu dochází k trvalému „umlčení“ MGMT genu, tedy po vystavení DNA alkylačním činidlům není poškozená DNA opravována a dochází ke spuštění preventivních ochranných mechanismů buněčného cyklu, které vedou k apoptóze.
Metylace promotoru MGMT genu souvisí s vyšší efektivitou chemoterapeutické léčby TMZ.

Metylace DNA patří mezi epigenetické procesy a zasahuje hlavně oblasti DNA s vysokým obsahem CpG ostrůvků. Tyto jsou rozmístěny nenáhodně v genomu a nejčastěji se nacházejí v regulačních oblastech genů – v promotorech. Metylace promotorů obvykle znamená transkripční inaktivaci genu díky deacetylaci histonů, čímž se indukuje formování inaktivního chromatinu. Metylace promotorů patří mezi klíčové epigenetické procesy tumorigeneze a zasahuje tumorsupresorové geny, DNA reparační geny, proapoptotické geny a geny kontrolující buněčný cyklus. Alterace metylačního vzorce může být prvotní událostí a vést k tumorigenezi.

Indikace vyšetření:

• u pacienta s glioblastomem multiforme

Stručně klinický význam:

• zjištění metylačního statutu promotoru genu MGMT, kdy v případě metylace promotoru genu lze očekávat lepší odpověď na léčbu temozolomidem

Materiál pro vyšetření:

• 2-3 vzorky nádorové tkáně o velikosti asi 3x3x3mm do roztoku RNA lateru, vzorky musí být v RNA lateru ponořené, odběrová zkumavka musí být označena štítkem se jménem a datem narození a zároveň 5 ml čerstvě odebrané venózní krve do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené štítkem se jménem a datem narození
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi.

Detekce metylace MGMT promotoru

• k detekci metylace MGMT promotoru provádíme konverzi nemetylovaného cytosinu na uracil (MethylampTM One-Step DNA modification Kit) a dále provádíme metylsenzitivní PCR se specifickými primery k detekci metylovaného a nemetylovaného promotoru, případně real-time PCR

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. ihned po odběru periferní krve (kontakt na telefonním čísle 724 813 359, 725 880 733). Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7 – 10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Myeloproliferativní neoplázie (MPN) vznikají patologickou transformací pluripotentní kmenové buňky, která má potenciál diferencovat v řadu granulocytární, erytroidní a megakaryocytární. Jsou charakterizovány chorobně zvýšenou tvorbou krvinek (granulocytů, monocytů, erytrocytů a trombocytů) v kostní dřeni.
Velká část pacientů s MPN nese získanou (somatickou) mutaci V617F v JAK2 genu v hematopoetické progenitorové nebo kmenové buňce. JAK2 je cytoplasmatická tyrozin kináza hrající důležitou roli při přenosu signálů mezi membránovými receptory hematopoetických růstových faktorů a intracelulárními signálními molekulami.
Bodová mutace – záměna guaninu (G) za tymin (T) v pozici 1849 cDNA v exonu 14 JAK2 genu (c.1849G>T) a tedy následně i záměna konzervativního valinu (V) za fenylalanin (F) v pozici 617 aminokyselinové sekvence (V617F) – v pseudokinázové autoinhibiční doméně proteinu má za následek porušení této autoinhibiční aktivity. Tato mutace vede tedy ke konstitutivní aktivaci JAK2 proteinu, což poskytuje hematopoetickým buňkám proliferační výhodu. Mutace se vyskytuje (dle různých studií) u 65-97 % pacientů s polycytémií vera (PV), 23-57 % pacientů s esenciální trombocytémií (ET) a u 23-95 % pacientů idiopatickou myelofibrózou (IMF). Stejná mutace byla také nalezena přibližně u 20 % Ph-negativních atypických CML, u více než 10 % pacientů s CMML, přibližně u 15 % pacientů s megykaryocytární AML (AML M7) a 1/5 pacientů s juvenilní myelomonocytární leukémií (JMML).

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve (popř. 3-4 ml kostní dřeně) odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená alespoň 2 identifikačními symboly (jménem + rodným číslem pacienta)
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Metoda detekce mutací:

• Průkaz mutace V617F v JAK2 genu se provádí analýzou DNA získané ze vzorku plné periferní krve (kostní dřeně) nebo granulocytární frakce buněk (neutrolily, basofily, eosinofily) metodou ARMS-PCR, příp. real-time PCR, sekvence

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) je membránový glykoprotein, s důležitou rolí v procesech proliferace, diferenciace a přežívání normálních buněk. Nadměrná exprese EGFR genu je popisována u různých typů solidních nádorů, včetně nemalobuněčného plicního karcinomu (NSCLC), nádory prsu, hlavy a krku, trávicího traktu, močového měchýře, vaječníků, kolorektálních nádorů a glioblastomů. Tato nadměrná exprese je v těchto případech spojována s pokročilým stupněm rozvoje onemocnění a horší prognózou.
Současné studie týkající se problematiky NSCLC, uvádějí, že u některých pacientů byly detekovány somatické mutace v genu pro EGFR. Výskyt těchto mutací zároveň koreluje s efektivitou účinku tyrozinkinázových inhibitorů (TKI), jako jsou gefitinib (Iressa) nebo erlotinib (Tarceva) při léčbě NSCLC. Výskyt aktivačních mutací v EGFR genu koreluje s vnímavostí nádoru na léčbu, zatímco přítomnost jedné z mutací, T790M, koreluje s rezistencí vůči TKI. Mutační status DNA nádoru pacienta může tudíž poskytnout účinný nástroj pro stanovení nejefektivnější strategie léčby NSCLC.

Materiál pro vyšetření:

• nádorová tkáň (o velikosti dle možností): nativní (uložená ve fyziologickém roztoku), zamražená, případně fixovaná (fixační roztok FineFix), uložená do sterilní nádoby (mikrozkumavky), transport do laboratoře v den odběru (případně do 24 hod.)
• parafínový bloček s největším zastoupením nádorové tkáně a s přesným označením lokalizace nádoru v daném bločku
• vyizolovaná DNA, rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi

Vyšetřované mutace v EGFR genu:

Průkaz těchto změn v EGFR genu se provádí metodou Real-Time PCR. Používaná technologie umožňuje detekovat 19 delecí v exonu 19 EGFR genu a mutace: L858R, L861Q, G719X, S768I a dále 3 inzerce v exonu 20 (bez rozlišení mezi jednotlivými změnami). Citlivost této metody umožňuje zachytit až 1 % mutovaných alel na pozadí alel bez mutace.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Metoda detekce mutací:

• TheraScreen EGFR29 Mutation kit (DxS, Diagnostic Innovations)

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Detekce somatických mutací W515L a W515K v MPL genu (myeloproliferative leukemia virus oncogene, OMIM *159530, lokalizovaném na chromosomu 1p34, kódující trombopoetinový receptor) je zahrnuta v současných klasifikačních kritériích u Ph negativních myeloproliferativních neoplázií (WHO 2008). Podle současných publikací jsou mutace v MPL genu detekovány přibližně u 5-10% pacientů s primární myelofibrózou (PMF) a 1-5% pacientů s esenciální trombocytémií (ET). Detekce mutací v MPL genu může tedy být pomocným diagnostickým markerem, který by mohl přispět k potvrzení diagnózy oproti reaktivním, sekundárním trombocytémiím a jiným MPN.

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta), případně 1-2 ml kostní dřeně odebrané do sterilní zkumavky s EDTA
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. V den odběru - vzorek do transportu skladovat při teplotě 2-8°C. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Metoda detekce mutací:

Real-time PCR (MPL W515L/K MutaScreenTM kit, Ipsogen), případně sekvenace exonu 10 MPL genu

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření

Fúzní gen BCR-ABL je důležitým molekulárním markerem chronické myeloidní leukémie (CML) – nachází se asi u 95% případů a nemocní s CML bez této přestavby se výrazně liší od těch, kteří mají gen BCR-ABL. Rovněž se fúzní gen BCR/ABL nachází asi u 5% dětských a 25% dospělých akutních lymfatických leukémií (ALL), kde přítomnost tohoto genu má prognostický význam.

Chronická myeloidní leukémie (CML) je klonální nádorové onemocnění vznikající neoplastickou transformací hemopoetické kmenové buňky. Představuje 15 % všech leukémií a současně 20 až 25 % leukémií dospělého věku. Incidence onemocnění je 1,6 nových případů na 100 tisíc obyvatel. V České republice je diagnostikováno 150 až 200 nových onemocnění ročně. Medián věku při stanovení diagnózy je 56 let. Onemocnění je charakterizováno heterogenitou průběhu, třífázovým -charakterem vývoje (chronickou, akcelerovanou fází a blastickým zvratem) a u 95 % nemocných přítomností charakteristické chromosomální abnormality - Ph-chromosomu („filadelfský chromosom“; Ph). Poprvé jej popsali v roce 1960 Nowel a Hungerford ve Filadelfii. Produktem Ph-chromosomu je fúzní gen BCR-ABL, vznikající reciprokou translokací mezi chromosomy 9 a 22 - t(9;22)(q34;q11). Touto přestavbou vzniklý fúzní gen podmiňuje vznik vlastního onemocnění. Typickým obrazem chronické fáze onemocnění, která má medián stabilizace pět až šest let, je leukocytóza v krevním obraze a v diferenciálním rozpočtu zastoupení všech vývojových stadií leukocytů s posunem pro blasty. Charakteristický je také obraz aspirátu kostní dřeně, v objektivním nálezu dominuje splenomegalie. Potvrzením diagnózy je průkaz Ph-chromosomu nebo detekce fuzního genu BCR-ABL. Vlastnosti nádorové buňky se však v průběhu onemocnění mění. Stává se agresivnější, zvyšuje se rychlost proliferace, ztrácí citlivost na léčbu a pacient se dostává do akcelerované fáze s mediánem trvání šest až devět měsíců. Třetí fází choroby je blastický zvrat, který má medián přežití tři až šest měsíců a má klinické příznaky už rozvinuté akutní leukémie.

Průkaz fuzního genu BCR-ABL je tedy důležitým molekulárním markerem pro určení diagnózy (CML) a prognózy některých leukemických onemocnění. Rovněž kvalitativní stanovení fúzního transkriptu BCR-ABL metodou reverzní transkriptázové polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) umožňuje identifikovat pacienty, u kterých po transplantaci kostní dřeně přetrvávají nebo se znovu objevily leukemické buňky, neboť svou citlivostí přesahuje citlivost běžně používaných metod cytogenetických (detekují přítomnost Ph chromosomu). Zda počet leukemických buněk narůstá, lze však zjistit až kvantitativní RT-PCR. U pacientů v cytogenetické i hematologické remisi umožňuje včasný záchyt tohoto fúzního genu - molekulární relaps - včasné zahájení léčby, která je méně náročná pro pacienta, méně nákladná a mnohem efektivnější.
V naší laboratoři provádíme kvalitativní stanovení fúzního transkriptu BCR-ABL a jeho možných molekulárních variant (major (M-BCR), minor (m-BCR), mikro (μ-BCR) pomocí metody reverzní transkriptázové polymerázové řetězové reakce (RT-PCR).

Materiál pro vyšetření:

Před odběrem kontaktovat laboratoř. Vzorek krve dopravit po odběru co nejdříve do laboratoře (výchozím krokem je izolace RNA)!

• 5-10 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), případně 1-4 ml kostní dřeně odebrané do sterilní zkumavky s EDTA, označené minimálně 2 identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta) a uvedením času odběru

Dokumentace:

• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

• před odběrem kontaktovat CGB laboratoř a.s., tel.: 725 880 733
• vzorek dopravit do laboratoře co nejdříve po odběru!, do transportu skladovat při +2°C až +8°C

Metoda detekce fuzního genu:

Izolace RNA, reverzní transkripce, multiplex-PCR a elektroforéza; případně real-timePCR

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Uvedený fúzní gen FIP1L1-PDGFRα bývá často nalézán u pacientů s myeloproliferativními neopláziemi spojenými s eozinofilií (zejména klonální hypereosinofilií – chronickou hypereosinofilní leukémií (CEL). Tento fúzní gen vzniká intersticiální delecí na chromosomu 4q12 a kóduje konstitutivně aktivovanou tyrozin kinázu. Frekvence výskytu fúzního genu FIP1L1-PDGFRα.se uvádí přibližně u 3-56 % pacientů s HES/CEL. Přítomnost tohoto fúzního genu je spojena se zvláště dobrou odpovědí na imatinib.

Materiál pro vyšetření:

Před odběrem kontaktovat laboratoř. Vzorek krve dopravit po odběru co nejdříve do laboratoře (výchozím krokem je izolace RNA)!

5-10 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), případně 1-4 ml kostní dřeně odebrané do sterilní zkumavky s EDTA, označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta) a uvedením času odběru

Dokumentace:

Přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s., tel.: 725 880 733 (před odběrem kontaktovat laboratoř) - vzorek dopravit do laboratoře co nejdříve po odběru!, do transportu skladovat při +2°C až +8°C. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Metoda detekce mutací:

IzolaceRNA, reverzní transkripce, nested-PCR a elektroforéza; real-time PCR

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření

Hereditární fruktózová intolerance (HFI, OMIM 229600) je autozomálně recesivní onemocnění projevující se neschopností metabolizovat fruktózu a podobné cukry (sacharóza, sorbitol). Fruktóza je jednoduchý sacharid obsažený hlavně v ovoci a medu. Onemocnění je způsobeno deficiencí enzymu - aldolázy B. Hlavní funkcí enzymu aldolázy B je štěpení tohoto cukru. Symptomy pacientů s HFI po příjmu potravy obsahující fruktózu, saracharózu nebo sorbitol jsou bolesti břicha, zvracení a hypoglykémie. Dlouhotrvající příjem fruktózy může vést k vážnému poškození jater a ledvin, což může mít za následek i smrt (zejména u malých dětí). Léčba spočívá v dietě, kdy jsou z potravy vyloučeny potraviny obsahující fruktózu, sacharózu a sorbitol.

Incidence tohoto onemocnění není přesně známá, ale uvádí se v rozmezí 1/12000 – 1/58000. Gen pro aldolázu B je lokalizován na 9 chromosomu. V tomto genu bylo popsáno více než tři desítky mutací. Z toho však tři mutace (A149P, A174D a N334K) jsou v evropské populaci velmi časté a představují přibližně více než 85% všech HFI mutantních alel.

Vyšetřované mutace v genu pro aldolázu B (AldoB):

• A149P (c.448G>C)
• A174D (c.524C>A)
• N334K (c.1005C>G)
• del4E4 (c.357delAAAC)

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Metoda detekce mutací:

Multiplex polymerázové řetězové reakce (PCR) s následnou reverzní hybridizací – kit Sugar Intolerance StripAssayTM (ViennaLab).

Transport vzorků do laboratoře

zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Hereditární hemochromatóza (HHC; OMIM 235200) je dědičná porucha metabolismu železa, projevující se střádáním železa v játrech, pankreatu, srdci, kloubech a hypofyse. Neléčená HHC může končit fatálně cirhózou, primárním hepatomem, diabetem nebo kardiomyopathií. Toto onemocnění postihuje 1 z 200- 400 osob.

V současné době je známo nejméně 5 forem tohoto onemocnění:

1. typ HFE1 - klasická hemochromatóza, mutace v genu HFE
2. typ HFE2A, HFE2B - juvenilní hemochromatóza, mutace v genech pro hemojuvelin (HJV) a hepcidin (HAMP)
3. typ HFE3 – mutace v genu TfR2 pro transferrinový receptor 2
4. typ HFE4 – mutace v genu SLC10A1 pro ferroportin1
5. typ HFE5 – mutace v genu H-ferritin

Klinický projev HHC je ovlivněn mnoha faktory, jak genetickými, tak i negenetickými (věk, pohlaví, dietní přísun železa, alkohol, infekce atd). Časné příznaky jsou nespecifické: únavnost, slabost, bolest kloubů, srdeční palpitace, a bolesti břicha. K příznakům plně vyjádřené choroby patří kožní hyperpigmentace, artritida, cirhosa, diabetes, chronická bolest břicha, chronický únavový syndrom, letargie, hypopituitarismus, hypogonadismus se ztrátou libida, kardiomyopathie, primární hepatokarcinom a zvýšené riziko některých infekcí (GIT). Prvním znamením při objektivním vyšetření je hepatomegalie. Při diagnóze je u 20-60 % nemocných již přítomna cirhóza. Hepatocelulární karcinom byl příčinou 30-45 % úmrtí nemocných s HHC. U všech pacientů s hepatocelulárním karcinomem je HHC přítomna u 11-15 %. Symptomy se obvykle objevují mezi 40.-60. rokem života, u žen vzhledem k menstruačním ztrátám později. Choroba u mužů se projeví častěji hepatopathií. U žen je to spíše chronická únava, artralgie a pigmentace. Neléčená HHC obecně snižuje délku života. Hlavním faktorem závažnosti onemocnění je vznik jaterní cirhosy. K té se často přidružuje diabetes. Zdá se, že úspěšné snížení obsahu železa je spojeno se zlepšením prognosy.

Typ HFE1

Hereditární hemochromatóza typu I je nejčastější typ onemocnění s autozomálně recesivním typem dědičnosti, které je způsobeno mutacemi v genu HFE. Gen HFE je lokalizován na krátkém raménku chromosomu 6 (6p21.3). Signifikantně jsou s HHC asociovány tyto alelické varianty genu HFE (z dosud 37 popsaných): C282Y, H63D a S65C, které jsou označovány jako kauzální mutace. V případě negativního nálezu pro tyto kauzální mutace může být pacient nosičem některé ze vzácných mutací genu HFE (V53M, V59M, P160delC atd.).
Produkt HFE genu - protein HFE - je transmembránový protein asociovaný s beta2-mikroglobulinem. Normální HFE protein se váže s transferinovým receptorem a 5-10x redukuje jeho afinitu k transferinu – hlavnímu transporteru železa. HFE protein je exprimován buňkami duoenálních krypt a svou asociací s transferinem reguluje vstřebávání železa.

Vyšetřované mutace v HFE genu:

• C282Y - majoritní mutace bělošské populace - průměrná populační frekvence homozygotů pro tuto mutaci se uvádí 0,4 % (1 : 250) a u heterozygotů 8-10 % (~1 : 10), mutace je asociována s vážnými fenotypovými projevy, homozygozita (mutace je přítomna na obou alelách genu) je přítomna u 52-96 % klinicky diagnostikovaných pacientů s HHC. Mutace vzniká záměnou Guaninu(G) za Adenin (A) v nukleotidové pozici 845 HFE genu (c.845G>A). Výsledkem je záměna aminokyseliny cysteinu (Cys, C) za tyrosin (Tyr, Y) v pozici 282 HFE proteinu (C282Y).
• H63D - frekvence heterozygotů v evropské populaci je 22 % (1 : 4), mutace je asociována s mírnějšími fenotypovými projevy, 5 % pacientů s HHC jsou složení heterozygoti C282Y/H63D a 1,5 % jsou homozygoti nesoucí pouze mutaci H63D. Mutace vzniká záměnou Cytosinu (C) Guaninem (G) na 187. nukleotidové pozici HFE genu (c.187C>G). Výsledkem je náhrada histidinu (His, H) aspartátem (Asp, D) na pozici 63 HFE proteinu (H63D)
• S65C - mutace je asociována s mírnějšími fenotypovými projevy, nalezena v 8 % případů HHC u nichž nebyla zjištěna mutace C282Y ani H63D. Mutace vzniká záměnou Adeninu (A) za Tymin (T) v nukleotidové pozici 193 HFE genu (c.193A>T), což má za následek náhradu aminokyseliny serinu (Ser, S) cysteinem (Cys, C) v proteinové pozici 65 HFE genu (S65C)
• V53M
• V59M
• H63H
• Q127H
• P160delC (478delC)
• E168Q
• E168X
• W169X
• Q283P

Typ HFE3

Hereditární hemochromatóza typu 3 (OMIM 604250,604720) je spojena s mutacemi v genu pro transferinový receptor 2 TfR2 a jedná se o dědičné autozomálně recesivní onemocnění.
Mutace v tomto genu nalézáme u pacientů s hemochromatózou, kterých nebyly prokázány mutace v HFE genu. Tento gen je lokalizován na chromosomu 7 v oblasti q22. Produktem genu je transferinový receptor 2, který má 48% shodu s transferinovým receptorem a je schopen vázat transferin.
Role tohoto proteinu není zcela objasněna, nicméně se předpokládá účast na regulaci homeostázy železa. Díky alternativnímu sestřihu existují dvě formy tohoto proteinu α a β. Produkt genu Tfr2 je převážně exprimován v játrech, forma také ve slezině, žaludku, svalech, prostatě a mononukleárech periferní krve. Forma je slabě exprimována ve většině tkání.
Klinický projev HFE3 je shodný s klasickým typem hemochromatózy.
Populační frekvence mutací není dosud přesně známa známa.

Vyšetřované mutace v TfR2 genu:

• E60X
• M172K
• Y250X
• AVAQ594-597del (12nukleotidová delece v exonu16, ztráta 4 aminokyselin)

Typ HFE4

Hereditární hemochromatóza typu 4 (OMIM 606069, 604653) je onemocnění s autozomálně dominantním typem dědičnosti, které je způsobeno mutacemi v genu SLC40A1. Tento gen je lokalizován na chromosomu 2 v oblasti q32 a kóduje protein ferroportin 1. Ferroportin 1 je exprimován v basolaterálních membránách zralých střevních enterocytů, v bazální membráně syncytiotrofoblastu placenty, v makrofázích, Kupfferových buňkách jater a v dřeni sleziny. Ferroportin 1 se účastní transportu železa ze střeva do séra, z matky na fetus a recyklace železa z opotřebovaných erytrocytů zpět do séra. Pacienti s tímto typem onemocnění mají často vysokou hladinu ferritinu v séru a normální saturaci transferrinu. Železo se ukládá převážně v jaterních makrofázích, v některých případech v hepatocytech. Často se také u pacientů projeví příznaky hraniční anémie. Pacienti s HFE typu 4 neodpovídají dobře na léčbu flebotomií.
Populační frekvence mutací není známa.

Vyšetřované mutace v SLC40A1 genu:

• N144H
• V162del

Detekce mutací v genech HFE, TfR2, SLC40A1

• principem detekce mutací spojených s rozvojem hereditární hemochromatózy je multiplex polymerázová řetězová reakce s následnou reverzní hybridizací – kit Haemochromatosis StripAssay ATM (ViennaLab)

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené štítkem se jménem a datem narození
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená alespoň 2 identifikačními symboly (jménem + rodným číslem pacienta)
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Transport vzorků do laboratoře

zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Hlavní příčinou vzniku cervikálního karcinomu (nádoru děložního krčku, děložního hrdla) je infekce HPV. Mezinárodní studie prokázaly, že prevalence HPV u žen s cervikálním karcinomem je 99,7 %. Prevalence HPV v běžné populaci se uvádí mezi 10 – 20 %. Další údaje hovoří o tom, že se HPV každoročně nakazí okolo 6 miliónů osob. Relativní riziko vývoje cervikálního karcinomu u žen s pozitivním HR HPV nálezem je 20 – 70 %. V ČR se ročně vyskytne kolem 1 000 nových případů cervikálního karcinomu a zhruba 400 pacientek na následky této diagnózy zemře.

Skupinou s nejčastějším výskytem HPV jsou sexuálně aktivní ženy (ale také muži) ve věku 20 – 25 let. Častěji se infekce vyskytuje u žen, které zahájily sexuální život dříve a měly větší počet partnerů. S rostoucím věkem se pravděpodobnost výskytu infekce snižuje, zvyšuje se však klinická závažnost přetrvávající infekce, a to u žen ve věku nad 30-35 let.

HPV jsou neobalené DNA viry. V současnosti je jich známo více než 100 typů. Dle schopnosti infikovat epitely se dělí na kožní a slizniční typy. Z hlediska rizikovosti a onkogenního potenciálu se dělí na tzv. low- (LR) a high-risk (HR) typy. Onkogenní potenciál mají HR typy. Velikost viru je kolem 55 nm, obsahuje kruhově uspořádanou dvouvláknovou DNA o velikosti cca 8000 párů bází. Virová DNA kóduje geny časné (E geny) a pozdní fáze (L geny) infekce.

Vstup HPV do organismu nastává nejčastěji mikrotraumaty kůže a sliznic, nejběžněji jako následek pohlavního styku. Často dochází ke spontánnímu ústupu infekce až do úplné likvidace imunitním systémem. Infekce může také ovšem přetrvávat a postupně se rozvíjet. V tomto případě se HPV DNA po určité době od infekce integruje do hostitelského (tj. lidského) genomu. Účinkem virových genů E6 a E7 dochází k onkogenní transformaci infikované buňky na nádorovou. Rozvoj infekce probíhá často za spoluúčasti rizikových faktorů (věk nad 30 let, rizikové sexuální chování, kouření, imunosuprese, dlouhodobá hormonální steroidní antikoncepce).

Klinické projevy infekce jsou rozmanité. Postižena bývá anální a genitální oblast, případně jiné kožní nebo slizniční oblasti (ústa, nos, spojivky). Infekce bývá latentní nebo s klinickými projevy. Nejbežnějším projevem infekce LR typy jsou kondylomata zevního genitálu, genitální bradavice, orální papilomy, keratózy, infekce HR typy způsobuje vývin vulvární intraepiteliální neoplázie, penilní intraepiteliální neoplázie a cervikální intraepiteliální neoplázie, která se může změnit až na cervikální karcinom.

Detekce virového genomu:

Diagnostiku HPV infekcí je možné provádět pomocí nepřímých a přímých metod. K nepřímé diagnostice se řadí kolposkopie, cytologické, histologické a sérologické vyšetření. Tyto metody zakládají potvrzení HPV infekce na průkazu přítomnosti charakteristických změn postižených tkání či buněk. Přímá diagnostika je založena na průkazu přítomnosti HPV částic či HPV DNA v postižených buňkách. Kromě elektronmikroskopie a imunohistochemie se převážně využívá metody polymerázové řetězové reakce (PCR), amplifikující specifický úsek virového genomu. K nejrozšířenějším přímým metodám detekce virového genomu patří technologie Hybrid Capture 2, využívající hybridizace komplementární RNA sondy s virovou DNA.

Materiál pro vyšetření:

Vzorky pro analýzu musí být označeny štítkem se jménem a příjmením pacienta a datem narození (nebo rodným číslem).

Vhodný materiál pro detekci HPV DNA:

• cervikální stěr, provedený sterilní odběrovou soupravou DNAPAP Cervical Sampler, do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C
• výtěr z uretry (u mužů) uložený do STM (součást odběrové soupravy DNAPAP Cervical Sampler), do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C

Dokumentace:

• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi.

Odběrové soupravy (s podrobným návodem k použití) poskytneme na požádání zdarma.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s - nejlépe do 72 hodin po odběru při teplotě +4 až +25°C. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Metoda detekce:

1. stanovení přítomnosti HR HPV DNA provádíme pomocí Hybrid Capture 2 – HR HPV DNA Test (Digene/Qiagen) - metoda detekuje přítomnost vysoce rizikových (HR) typů HPV (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68; bez rozlišení jednotlivých typů)
2. genotypizace HPV typů pomocí INNO – LiPA HPV Genotyping Extra CE kitu (INNOGENETICS) - touto metodou lze typizovat jednotlivé HPV typy (HR HPV 16, 18, 31, 33, 45, 51, 53, 58, 59, 66, 68; LR HPV 6, 11, 40, 54, 70).

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno během 1 měsíce od převzetí vzorku (v závislosti na počtu přijatých vzorků v daném období)
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Chlamydia trachomatis (C. trachomatis, CT) patří mezi nejčastější pohlavně přenosné bakteriální onemocnění. Ročně se jimi v Evropě nakazí okolo 3 miliónů lidí, v USA dokonce 4 milióny, z nichž drtivá většina zůstává nediagnostikována. Přesná prevalence v ČR není známa, ale údaje z okolních států udávají výskyt u 5 – 15 % osob celkové populace. Nejrizikovější skupinou je sexuálně aktivní mládež (zvláště dívky) do 20 let a dospělí (především ženy) ve věku 20-24 let. Nejčastější je výskyt u adolescentních dívek a mladých žen.

C. trachomatis je nepohyblivý, obligátně intracelulární, gram-negativní bakteriální organismus. Chlamydiální infekce jsou zodpovědné za cervicitidu, záněty pánve, dětskou i adultní konjunktivitidu a pneumonitidu, uretritidu, epididymitidu, proktitidu a další komplikace. Infekce probíhá velice často bezpříznakově, 70-80 % žen a více než 50 % mužů nemá žádné příznaky onemocnění. I když v mnoha případech zůstává infekce zdánlivě asymptomatická, jsou následky neléčené chlamydiózy, zvláště u žen, velmi závažné. Mohou vyústit v neplodnost, záněty pánevních orgánů, chronické bolesti a také v mimoděložní těhotenství. Hluboký pánevní zánět je celosvětově velkým zdravotním, sociálním a ekonomickým problémem. Důležité jsou i jeho již výše uvedené pozánětlivé následky (tubulární sterilita a mimoděložní těhotenství). V evropských studiích byla u 60 % případů jako původce salpingitis diagnostikována C. trachomatis.

Chlamydiové infekce jsou v České republice nadále podceňovány, není zaveden rutinní screening a přetrvává jejich vysoká incidence. Příznaky infekce u žen jsou nejčastěji poševní výtok a dysurie. Poměrně časté je i postkoitální krvácení. Chlamydiální záněty pánevních orgánů jsou provázeny bolestmi v pánevní, děložní a adnexální oblasti. U mužů je infekce obtížně odlišitelná od gonokokální uretritidy.

Materiál pro vyšetření:

Vzorky pro analýzu musí být označeny štítkem se jménem a příjmením pacienta a datem narození (nebo rodným číslem).

Vhodný materiál pro detekci CT DNA:

• cervikální stěr, provedený sterilní odběrovou soupravou DNAPAP Cervical Sampler, do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C
• výtěr z uretry (u mužů) uložený do STM (součást odběrové soupravy DNAPAP Cervical Sampler), do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C

Dokumentace:

• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi.

Odběrové soupravy (s podrobným návodem k použití) poskytneme na požádání zdarma.

Transport vzorků do laboratoře:

• zajištěn svozem CGB laboratoře a.s
• nejlépe do 72 hodin po odběru při teplotě +4 až +25°C

Metoda detekce:

• stanovení přítomnosti CT DNA provádíme pomocí Hybrid Capture 2 – CT ID DNA Testu (Digene/Qiagen)

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno během 1 měsíce od převzetí vzorku (v závislosti na počtu přijatých vzorků v daném období)
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Kolorektální karcinom nebo-li rakovina tlustého střeva a konečníku patří celosvětově k nejrozšířenějším nádorovým onemocněním. V České republice patří kolorektální karcinom k nejčastějším nádorovým onemocněním, incidence tohoto onemocnění trvale roste a podle některých statistik jsme v celosvětovém měřítku ve výskytu této choroby u mužů na prvním místě. Onemocnění se nejčastěji vyskytuje u lidí nad 50 let (nejvyšší výskyt nových případů je mezi 60. a 70. rokem života). Až u jedné čtvrtiny nemocných jsou v okamžiku stanovení diagnózy přítomny metastázy (tj. šíření nádorů do dalších orgánů, nejčastěji jater a plic) a pětileté přežití těchto pacientů je nižší než 5%. Mezi typické příznaky tohoto onemocnění patří zejména přítomnost krve ve stolici, pocit stálého nucení na stolici po vyprázdnění, bolest břicha, pocit „špatného zažívání“, střídání zácpy a průjmu, nevysvětlitelný úbytek hmotnosti, stálý pocit únavy. Léčba nádorových onemocnění je náročná a volba léčebné strategie záleží na velikosti nádoru, jeho lokalizaci a pokročilosti onemocnění. V protinádorové léčbě se uplatňují čtyři základní léčebné postupy a to chirurgický (operační odstranění celého nádoru), chemoterapie (podávání látek, které zabraňují množení buněk), radioterapie (ozáření nádoru) a biologická léčba a to díky pokrokům v molekulární biologii, které umožnily poodhalit patogenezi nádorového procesu a vedly k objevu nových látek s protinádorovými účinky - výsledkem je terapie nádorů cílená na určité molekuly exprimované nádorovými buňkami – tzv. cílená biologická léčba. Principem účinku této biologické cílené léčby onkologických onemocnění je zamezení růstu nádorových buněk tím, že lék zablokuje určité molekuly (receptory), které „spouštějí“ dělení a růst nádorových buněk, přičemž neovlivňuje buňky zdravé. V současnosti jsou k dispozici pro léčbu kolorektálního karcinomu dostupné monoklonální protilátky namířené proti receptorům pro epidermální růstový faktor (tzv. anti-EGFR moAb) - cetuximab, resp. panitumumab.

Avšak aby i tato léčebná strategie mohla být účinná, je nutné znát stav některých dalších faktorů, které mohou ovlivnit výsledek léčby, ty pak slouží jako markery, pomocí nichž lze předvídat, zda bude tato léčba úspěšná, či nikoli. Takovýmto biomarkerem, který umožní predikci účinnostianti EGFR moAb u pacientů s kolorektálním karcinomem je přítomnost mutací v K-ras genu (OMIM*190070).

Detekce mutací v K-ras genu

Gen K-ras patří do skupiny protoonkogenů, kóduje protein, který je součástí signální dráhy receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR). K-ras gen je lokalizován na 12. chromosomu v oblasti 12p12.1. Účastní se přenosu signálu od aktivovaného receptoru do jádra. Aktivační mutace v tomto genu mají za následek stimulaci dané signální dráhy nezávisle na stavu EGFR. Tedy přítomnost těchto aktivačních mutací vede k rezistenci nádoru vůči působení monoklonálních protilátek namířených proti EGFR. Tyto mutace se vyskytují přibližně u 35-45% kolorektálních karcinomů (více než 90% mutací je lokalizováno v kodonu 12 a 13 K-ras genu). Mutace v genu K-ras slouží jako biomarker pro následnou individualizovanou léčbu.

Pro cílenou biologickou léčbu kolorektálního karcinomu monoklonálními protilátkami proti EGFR by mělo být vyžadováno vyšetření mutací v genu K-ras, neboť pouze pacienti, v jejichž nádoru nebyla prokázána přítomnost mutací v K-ras genu (tedy nemutovaný gen K-ras, K-ras wild-type) jsou vhodní pro tento druh terapie a lze u nich očekávat pozitivní terapeutickou odpověď.

Detekce mutace V600E v BRAF genu

Mutace v K-ras genu mohou vysvětlit pouze 30-40% rezistence na léčbu monoklonálními protilátkami proti EGFR (cetuximab, panitumumab) u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mCRC). Současné poznatky naznačují, že poškození dalších proteinů v EGFR signální kaskádě, jako například BRAF mutace a deregulace PIK3CA/PTEN signální dráhy mohou vést k rezistenci na anti-EGFR terapii.

Gen BRAF (OMIM 164757) je lokalizován na chromosomu 7q34, kóduje protein patřící k rodině raf/mil serin/threoninových kináz. Protein hraje důležitou úlohu v regulaci MAP kináz/ERK signální dráhy, která ovlivňuje buněčné dělení, diferenciaci a sekreci. Mutace v tomto genu jsou asociovány s celou řadou nádorů (kolorektální karcinom, maligní melanom, non-Hodgkin lymfom, karcinom štítné žlázy, nemalobuněčný karcinom plic a adenokarcinom plic). Nejčastější změnou v BRAF genu (>90%) je bodová mutace V600E (záměna aminokyseliny valinu za kyselinu glutamovou v pozici 600 aminokyselinové sekvence). Tato mutace má za následek konstitutivní aktivaci BRAF proteinu. Přítomnost této mutace je asociována s nedostatečnou odpovědi na léčbu pomocí anti-EGFR moAb u pacientů (s wild-type K-ras genem). Určení mutační statutu K-ras a BRAF genu u pacientů s pokročilým stádiem kolorektálního karcinomu by tedy mohlo poskytnout důležitou informaci při rozhodování o volbě léčebné strategie.

Materiál pro vyšetření:

• nativní, zamražená, případně fixovaná nádorová tkáň o velikosti min. 3x3x3mm, uložená do sterilní nádoby (mikrozkumavky), transport do laboratoře v den odběru (případně do 24 hod.)
• parafínový bloček s největším zastoupením nádorové tkáně a s přesným označením lokalizace nádoru v daném bločku
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi

Vyšetřované mutace v K-ras genu:

Analýza 10 mutací (G12A, G12D, G12R, G12C, G12S, G12V, G12I, G12L, G13C, G13D) v kodonu 12 a 13 k-ras genu se provádí pomocí PCR a následné reverzní hybridizace kitem K-ras StripAssay (ViennaLab), případně pomocí real-time PCR (detekce 7 mutací) za použití kitu TheraScreen K-RAS Mutation Test Kit (DxS Ltd).

Uvedené metody jsou velmi citlivé - schopná detekovat až 1% DNA s mutací na pozadí genomické DNA bez mutace.

Detekce mutace V600E v BRAF genu:

Sekvenčně specifická PCR, případně sekvence exonu 15 BRAF genu

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 1-3 týdnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Laktózová intolerance (OMIM 223100) je nejčastější forma disacharidázové deficience a jedná se o neschopnost trávit laktózu, která je hlavním cukrem obsaženým v mléce.
Laktózová intolerance je v podstatě normální fyziologický stav, jehož příčinou je snížená aktivita enzymu laktázy - phlorizin hydrolázy. Snížení aktivity enzymu je u člověka geneticky determinováno navzdory pokračujícímu příjmu laktózy v potravě.

Tento stav může být klinicky prezentován různorodými intestinálními příznaky jako je nadýmání, sytost, břišní koliky nebo průjem po přijetí potravy obsahující laktózu. Odhaduje se, že 7-20% bělošské populace trpí intolerancí laktózy. Intolerance se projevuje v jakémkoli věku a muži i ženy jsou postiženi stejně.

Enzym laktáza - phlorizin hydroláza je kódován genem LCT, který je lokalizován na chromosomu 2q21. Laktáza – phlorizin hydroláza má dvě enzymatické aktivity – laktázovou – hydrolyzuje mléčný cukr laktózu na glukózu a galaktózu – a phlorizin hydrolázovou.

Exprese genu LCT je regulována a tato regulace zahrnuje transkripční a posttranskripční kontrolu. Transkripční regulace se ukazuje jako nejdůležitější faktor, který ovlivňuje hladinu enzymu laktázy – phlorizin hydrolázy. Se sníženou aktivitou enzymu jsou asociovány jednonukleotidové polymorfismy C/T -13910 a G/A -22018 , které jsou ve vzdálenosti 14 a 22 kb před genem LCT a které snižují transkripci genu LCT a tímto tak ovlivňují a vlastně snižují hladinu enzymu. S tímto jevem se pojí dva stavy laktázy:

• laktázová perzistence – normální aktivita laktázy
• laktázová non – persistence (intolerance laktózy) – snížená aktivita laktázy.

Další často užívané termíny spojené s fenotypem snížené aktivity laktázy: hypolaktázie, adultní hypolaktázie, alaktázie, laktózová malabsorpce, laktózová maldigesce, intolerance mléka

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• případně zamražené střevní biopsie
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením

Detekce 2 sekvenčních variant asociovaných se sníženou aktivitou laktázy

V naší laboratoři provádíme detekci 2 sekvenčních variant asociovaných se sníženou aktivitou laktázy: C/T -13910 a G/A -22018 lokalizovaných v intronech 9 a 13 MCM6 genu pomocí multiplex polymerázové řetězové reakce (PCR) s následnou reverzní hybridizací – kit Sugar Intolerance StripAssayTM (ViennaLab).

Transport vzorků do laboratoře – zajištěn svozem CGB laboratoře a.s.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Na dlouhém raménku chromosomu Y jsou tři tzv. AZF oblasti (Azoospermia Factor) – a,b,c, obsahující geny, které řídí či ovlivňují vývoj spermií. Delece (ztráty) těchto genů jsou velmi malého rozsahu, a tudíž nejsou zjistitelné klasickými cytogenetickými metodami (OMIM 400 003; OMIM 415 000; OMIM 480 000).Vznikají většinou de novo (jako chyba) v oplodňující spermii nebo v prvních buňkách embrya. Tato porucha je příčinou až 10 % těžkých forem neplodnosti. Nejzávažnější jsou obvykle delece v oblasti AZFa. Delece v AZF b + c oblastech jsou různorodější, a to od úplného chybění zárodečných buněk v kanálcích varlete až po rychle se snižující plodnost (s rostoucím věkem).
Metody asistované reprodukce umožňují v současnosti takto postiženým mužům mít vlastní děti. Vzhledem k přítomnosti výše uvedené poruchy u těchto mužů lze očekávat, že jejich potomci mužského pohlaví ponesou stejnou poruchu jako jejich otcové. Nicméně, při průkazu delece Y chromosomu se nabízí možnost preimplantační volby pohlaví.

Indikace vyšetření:

Porucha plodnosti u mužů: azoospermie nebo těžká oligospermie.

Stručně klinický význam:

Diagnostika – stanovení příčiny neplodnosti u mužů. Má význam pro genetické poradenství a prognózu. Nevylučuje fertilizaci in vitro, ale je zde riziko stejného postižení u mužského potomka.

Diagnostické testování delecí:

• provádíme PCR amplifikaci vybraných oblastí Y chromosomu (STS markery)
• k detekci je použit Multiplex oligo-azoospermia kit 1-2 (firma EXPERTEAM)

Vyšetřované STS markery, SRY a ZFX/ZFY:

• vyšetřujeme tyto STS markery na dlouhém raménku chromosomu Y: sY84, sY86 (AZFa na Yq11.21), sY127, s134 (AZFb na Yq11.22), sY254, sY255 (AZFc na Yq11.23) – dle doporučení EMQN
• do analýzy jsou zahrnuty dvě kontrolní oblasti na krátkém raménku chromosomu Y: gen SRY a ZFX/ZFY

Analýzou těchto STS je možno detekovat 95 % delecí v uvedených třech AZF oblastech.

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené štítkem se jménem a datem narození
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s.

• FV (Leiden, R2)
• FII-protrombin (G20210A)
• MTHFR (C677T, A1298C)
• β-fibrinogen (-455G>A)
• FXIII (V34L)
• PAI-1 (4G/5G)
• GPIIIa (L33P)
• ApoB(R3500Q)
• ApoE E2/E3/E4
• ACE (I/D)

Kardiovaskulární choroba (CVD) je obecně používaným termínem pro onemocnění srdce a cévního systému. K dnešnímu dni je znám velký počet genetických změn, u nichž byla buď prokázána, nebo se předpokládá spojitost se vznikem kardiovaskulárních onemocnění. V kombinaci s dalšími rizikovými faktory, jak negenetickými (kouření, nadváha, dietní návyky, věk, nedostatečný pohybový režim, pozitivní amamnéza), tak genetickými (současná přítomnost více mutací či polymorfismů najednou), se riziko rozvoje choroby dále zvyšuje. Genetická predispozice k CVD může být způsobena výskytem mutací a polymorfismů v celé řadě genů kódujících proteiny účastnících se především procesu srážení krve (koagulační faktory), fibrinolýzy, regulace krevního tlaku, ale také metabolismu lipidů a homocysteinu. Mutace v těchto genech mohou být příčinou celoživotně zvýšeného rizika vzniku kardiovaskulárních onemocnění. Mezi kandidátní geny, jejichž určité sekvenční varianty mohou být asociovány s rozvojem CVD, patří geny pro:

• koagulační faktor V (FV)
• faktor II (protrombin)
• faktor XIII (FXIII)
• 5,10 – metylentetrahydrofolát reduktázu (MTHFR)
• angiotensin konvertující enzym (ACE)
• β – fibrinogen (FGB)
• destičkový glykoprotein IIIa (GPIIIa)
• inhibitor aktivátoru plazminogenu (PAI – 1)
• apolipoprotein B (Apo B) a apolipoprotein E (Apo E)

Koagulační faktor V - FV (Leiden, Cambridge a R2 mutace)

(OMIM 227400)

Faktor V je kofaktorem pro přeměnu protrombinu na trombin.

Leidenská mutace ve faktoru V: G1691A nebo také Arg506Gln (R506Q), tato mutace postihuje kritická štěpná místa proteinu s následným ovlivněním jeho aktivity. Relativní riziko vzniku trombóz hlubokých žil je u heterozygotních přenašečů 5 – 10 x vyšší než u běžné populace, u homozygotů je toto riziko až 80 x vyšší.
R2 mutace ve faktoru V: A4070G nebo také His1299Arg (H1299R). FV R2 zvyšuje riziko žilní trombózy zvláště ve spojení s Leidenskou mutací (uvádí se až 10x vyšší riziko trombózy), rovněž se uvádí, že průměrný věk první tromboembolické příhody je o 6 let nižší u jedinců, kteří jsou heterozygoti pro FV Leiden a FV R2.

Koagulační faktor II – FII protrombin (mutace G20210A)

(OMIM 176930)

Protrombin je inaktivním prekurzorem trombinu.

Mutace G20210A je asociována se zvýšenou hladinou protrombinu. Heterozygotní přenašeči mají o 30 % zvýšenou hladinu plazmatického protrombinu a 2-3x vyšší riziko trombózy hlubokých žil. S uvedenou mutací je rovněž spojováno zvýšené riziko vzniku mozkové a hluboké žilní trombózy, plicní embolie. Riziko dále narůstá především v těhotenství, operativních zákrocích, imobilizaci, kouření, obezitě atd.

Enzym metylentetrahydrofolát reduktázu – MTHFR (C677T, A1298C)

(OMIM 607093)

MTHFR se účastní regulace metabolismu homocysteinu.

Heterozygoti a homozygoti nesoucí uvedené sekvenční varianty mívají redukovanou aktivitu tohoto enzymu (homozygoti nesoucí mutaci C677T mají cca 30% aktivitu enzymu MTHFR oproti jedincům bez mutace), která může vést k hyperhomocysteinémií (OMIM 236250), která patří mezi rizikové faktory kardio- a cerebrovaskulárních chorob, rovněž vysoká hladina homocysteinu může vést k defektům neurální trubice během prenatálního vývoje.

Koagulační faktor XIII – FXIII (V34L)

(OMIM 134570)

Faktor XIII hraje důležitou roli při stabilizaci krevních sraženin díky schopnosti sesíťovat fibrinová vlákna (účinkem aktivovaného faktoru XIII (FXIIIa) a v přítomnosti Ca2+ dochází k tvorbě pevných příčných vazeb mezi jednotlivými vlákny fibrinu a vytváří se tak trojrozměrná síť stabilního, mechanicky odolného nerozpustného fibrinu) Polymorfismus V34L (Val34Leu) v genu FXIII se vyskytuje zhruba u 23 % kavkazské populace; V34L způsobuje předčasné vyčerpání pozměněného proteinu z krevního oběhu, což snižuje tvorbu nerozpustného fibrinu a tak může mít antitrombotický efekt.

Destičkový glykoprotein III – GPIIIa (L33P)

(OMIM +173 470)

Integrin beta-3 gen (ITGB3) kóduje glykoprotein IIIa (GPIIIa), podjednotku destičkového membránového receptorového komplexu GPIIb/GPIIIa

Komplex GPIIb/GPIIIa řídí shlukování destiček, neboť funguje jako receptor pro fibrinogen (také pro fibronektin a von Willebrandův faktor).
Sekvenční varianta L33P: záměna tyminu (T) za cytosin (C) v nukleotidové pozici 1565 genu GPIIIa, tato záměna nukleotidu způsobuje záměnu aminokyseliny leucinu (L) za prolin (P) v pozici 33 proteinu.
Nejčastější varianta genu nesoucího v pozici 33 proteinu GPIIIa aminokyselinu leucin je známá pod označením Pl A1 (HPA – 1a).
Varianta genu nesoucího v pozici 33 proteinu GPIIIa aminokyselinu prolin je známá pod označením Pl A2 (HPA – 1b), touto záměnou dochází ke změnám v prostorovému uspořádání proteinu.
Frekvence výskytu Pl(A2) je zhruba 15% v bělošské populaci.
Varianta Pl (A2) může zvyšovat riziko tromboembolických komplikací u koronární srdeční choroby, rovněž byla pozorována vyšší frekvence výskytu této varianty u rodin s četnými infarkty myokardu.
Společný výskyt varianty 4G v genu pro PAI-1 a Pl(A2) může zvyšovat riziko infarktu myokardu.
L33P je také zodpovědná za neonatální alloimunitní trombocytopeniia postransfúzní purpuru.

Angiotensin konvertující enzym - ACE (polymorfismus I/D)

(OMIM +106180)

ACE přeměňuje angiotensin I na angiotensin II hraje důležitou roli v regulaci krevního tlaku.

Hladina ACE v plazmě se může u zdravých osob lišit až pětinásobně; uvádí se,že až 50 % této variability je způsobeno uvedeným polymorfismem.
Frekvence výskytu DD genotypu se v celkové populaci uvádí 27 %.
Genotyp D/D genotyp je spojen vyšší hladinou ACE v séru a rizikem vzniku ischemické choroby srdeční (ICHS).

β-fibrinogen - FGB (-455G>A)

(OMIM 134830)

Fibrinogen je plasmatický glykoprotein – molekulu tvoří dimer složený z řetězců α, β, γ (kódovanými třemi různými geny)

Fibrin je důležitý pro vazbu krevních destiček; mutace -455 G→A: záměna guaninu (G) za adenin (A) v pozici -455 promotorové oblasti genu kódujícího FGB
Mutace je asociována se zvýšenou hladinou plasmatického fibrinogenu u obou pohlaví a tato vyšší koncentrace v krvi bývá spojována i s některými chorobami např. cerebrovaskulárními.

Inhibitor aktivátoru plazminogenu – PAI-1 (4G/5G)

(OMIM 173360)

PAI-1 je součástí fibrinolytického systému a hraje důležitou roli v kontrole koagulace.

Váže se na tkáňový plasminogen a inhibuje aktivaci plasminogenu.
Polymorfismus 4G/5G: jedná se o deleci/inzerci jednoho guanosinu (G) v pozici -675 v promotorové oblasti genu PAI-1. 4G alela je asociována se zvýšenou transkripcí genu PAI-1 a zvýšenou hladinou plasmatického PAI-1 proteinu. Homozygoti s genotypem 4G/4G mají hladinu plasmatického PAI-1 o 25% vyšší než homozygoti s genotypem 5G/5G. Vyšší hladina plasmatického PAI-1 je asociována s progresí koronárního syndromu a rozvojem infarktu myokardu. U těhotných žen s genotypem 4G/4G je pozorován vyšší výskyt komplikací během těhotenství.

Apoliporotein B - ApoB (R3500Q)

(OMIM 107730)

Uskutečňuje transport lipidů v séru ve formě lipoproteinových komplexů (LDL).

ApoB má klíčový význam pro vazbu na LDL receptory.
Gen ApoB kóduje dvě formy apolipoproteinu (jedna forma je syntetizována v hepatocytech (ApoB-100) a druhá v epiteliálních střevních buňkách (ApoB 48).
Sekvenční varianta R3500Q: záměna guaninu (G) za adenin (A) v nukleotidové sekvenci na pozici 10708 genu kódujícího ApoB, tato záměna nukleotidu způsobuje záměnu aminokyseliny argininu (R) za glutamin (Q) v pozici 3500 proteinu. Pro správnou funkci proteinu je nutné správné složení proteinu - nutná vzájemná interakce argininu (R) v pozici 3500 a tryptofanu v pozici 4369 proteinové sekvence - mutace R3500Q má za následek nesprávné složení proteinu a tím i snížení vazebné schopnosti pro LDL receptor, což má za následek zvýšení hladiny na cholesterol bohatých LDL částic. Frekvence této mutace se v kavkazské populaci pohybuje v rozmezí 1:500 - 1:700.
Defekt ApoB-100 je příčinou hypercholesterolemie (tzv. FDB- familiární defekt apolipoproteinu-B -autozomálně dominantního onemocnění).

Apoliporotein E - ApoE (E2/E3/E4)

(OMIM 107741)

Protein podílející se na transportu, skladování a metabolismu cholesterolu.

Nejčastější jsou tři izoformy apolipoproteinu E: Apo E2, E3, E4 - kódované třemi alelami (ε2, ε3, ε4 – existuje tedy 6 možných genotypů: 3/3, 4/3, 3/2, 4/4, 4/2 a 2/2– seřazeny od nejčastějšího po nejméně častý).
Jednotlivé izoformy se liší ve dvou místech v aminokyselinové sekvenci (v pozici 112 a 158) E2 má v proteinu na obou pozicích cystein, E3 má v sekvenci proteinu cystein a arginin, E4 má v proteinové sekvenci na obou pozicích arginin.
Nejčastěji vyskytující se alelou je alela ε3.
Alela ε4 je spojována se zvýšenou hladinou plasmatického cholesterolu a tím i zvýšeným rizikem ICHS.
Rovněž mnohé studie ukazují, že alela ε4 je spojena s vyšším rizikem rozvoje Alzheimerovy choroby (AD) a snížením průměrného věku začátku choroby (~65% pacientů s AD nese alespoň jednu alelu ε4 a 12-15% jsou homozygoti nesocí alelu ε4/ ε4, v běžné populaci je frekvence homozygotů nesoucích alelu ε4 ~ 1-3%).
Alela ε2 má nižší afinitu pro LDL receptor a je asociována s hyperlipoproteinemií typu III.

V naší laboratoři vyšetřované mutace a polymorfismy:

• v genu pro koagulační fakor V - FV Leiden – (R506Q) - FV R2 – (H1299R)
• v genu pro faktor II - FII (protrombin) – G20210A
• v genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu (MTHFR) – C677T, A1298C
• v genu pro faktor XIII (FXIII) – V34L
• v genu pro angiotensin konvertující enzym (ACE) – Ins/Del
• v genu pro β– fibrinogen (FGB) - -455 G>A
• v genu pro destičkový glykoprotein IIIa (GPIIIa) – L33P
• v genu pro inhibitor aktivátoru plazminogenu (PAI -1) – 4G/5G (-675delG)
• v genu pro apolipoprotein B (Apo B) – R3500Q
• v genu pro apolipoprotein E (Apo E) – E2/E3/E4

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením

Metoda detekce:

Multiplex polymerázová řetězové reakce (PCR) s následnou reverzní hybridizací – kity CVD StripAssayTM, CVD StripAssay TTM(ViennaLab).

Transport vzorků do laboratoře – zajištěn svozem CGB laboratoře a.s.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Mycoplasma genitalium (M. genitalium) je jedním z pohlavně přenosných bakteriálních onemocnění. Jedná se o nejmenší volně žijící bakterie, mají nejmenší genom i počet genů. Nejčastěji infikuje urogenitální trakt, ačkoli byly popsány i případy infekce jiných tělních tkání a orgánů.

Ačkoli nejsou známa přesná čísla pro Českou Republiku, údaje z výzkumů v USA uvádějí, že infekce M. genitalium je třetí nejčastější pohlavně přenosnou chorobou a se vyskytuje až u 1 % populace, zvláště pak u mladých lidí. U žen je infekce M. genitalium běžně nalézána ve spojení s bakteriální vaginitidou, dále je infekce tímto patogenem příčinou cervicitidy a uretritidy. I když v mnoha případech probíhá infekce zdánlivě asymptomaticky, následky neléčené infekce mohou dále vyústit v pánevní zánětlivou chorobu (pelvic inflammatory disease, PID), (akutní) endometritidu či být příčinou předčasného porodu, popř. abortu. U mužů je jednou z hlavních příčin výskytu negonokokální uretritidy.

Kultivace tohoto patogenu je velmi obtížná a trvá několik týdnů až měsíců. Sérologická vyšetření jsou pro rutinní diagnostiku nevhodná. Z tohoto důvodu se vyšetření provádí metodou real-time PCR, umožňující včasné zachycení přítomnosti DNA infekčních agens a následné zahájení léčby. Citlivost této metody umožňuje zachytit se 100% přesností nejméně 500 kopií genomu M. genitalium (v 1ml vzorku).

Materiál pro vyšetření

Vzorky pro analýzu musí být označeny štítkem se jménem a příjmením pacienta a datem narození (nebo rodným číslem).

Vhodný materiál pro detekci M. genitalium:

• cervikální stěr, provedený sterilní odběrovou soupravou DNAPAP Cervical Sampler, do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C
• výtěr z uretry (u mužů) uložený do STM (součást odběrové soupravy DNAPAP Cervical Sampler), do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C
• močový sediment (první proud moči), do transportu uložit vzorek v chladničce

Odběrové soupravy poskytneme na požádání zdarma.

Dokumentace:

Přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi.

Transport vzorků do laboratoře – zajištěn svozem CGB laboratoře a.s.

Metoda detekce

Detekce přítomnosti DNA M. genitalium se provádí metodou real-time PCR pomocí Mycoplasma genitalium Real-TM kitu (Sacace).

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno během 7 – 10 pracovních dnů po převzetí vzorku (v závislosti na počtu přijatých vzorků v daném období)
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae, GC) je nepohyblivá, aerobní, gramnegativní bakterie. U žen je infekce N. gonorrhoeae, ať už symptomatická či asymptomatická, příčinou endocervicitidy, uretritidy a často pánevní zánětlivé chorobu (pelvic inflammatory disease, PID). Následkem této infekce dochází často ke zjizvení vejcovodů, což může být jednou z příčin neplodnosti. Dalším z nepříznivých účinků je až 10-ti násobné zvýšení rizika mimoděložního těhotenství či endometritida. Infekce N. gonorrhoeae dále až pětinásobně zvyšuje riziko HIV infekce při kontaktu s tímto virem.

U mužů je jednou z hlavních příčin výskytu gonokokální uretritidy. Předběžná diagnóza Neisseria gonorhoeae se tradičně provádí tak, že se izolují organismy z kultur klinických vzorků s použitím Gramova barvení pro morfologická pozorování. Definitivní diagnóza může být stanovena pozitivním oxidázovým nebo katalázovým testem. Lepších výsledků lze dosáhnout detekcí antigenů a hybridizací specifických sond s nukleovými kyselinami patogenu.

V poslední době se metody hybridizace nukleových kyselin používají pro detekci Neisseria gonorrhoeae u klinických vzorků ohrožených skupin obyvatelstva, přičemž se používají jak endocervikální vzorky od žen, tak i uretrální vzorky mužských pacientů. Mezi tyto testy patří i námi používaná technologie Hybrid Capture 2, využívající hybridizace komplementární RNA sondy s bakteriální DNA.

Materiál pro vyšetření:

Vzorky pro analýzu musí být označeny štítkem se jménem a příjmením pacienta a datem narození (nebo rodným číslem).

Vhodný materiál pro detekci GC DNA:

• cervikální stěr, provedený sterilní odběrovou soupravou DNAPAP Cervical Sampler, do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C
• výtěr z uretry (u mužů) uložený do STM (součást odběrové soupravy DNAPAP Cervical Sampler), do transportu uložit vzorek při teplotě +4 až +25°C

Dokumentace:

Přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi.

Odběrové soupravy (s podrobným návodem k použití) poskytneme na požádání zdarma.

Transport vzorků do laboratoře:

• zajištěn svozem CGB laboratoře a.s
• nejlépe do 72 hodin po odběru při teplotě +4 až +25°C

Metoda detekce:

Stanovení přítomnosti GC DNA provádíme pomocí Hybrid Capture 2 – GC ID DNA Testu (Digene/Qiagen).

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno během 1 měsíce od převzetí vzorku (v závislosti na počtu přijatých vzorků v daném období)
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat molekulárně genetické vyšetření.

Smith-Lemli-Opitz syndrom (SLO syndrom, OMIM 270400) je relativně časté autozomálně recesivní onemocnění, které bylo poprvé popsáno v roce 1964 Davidem Smithem, belgickým pediatrem Lucem Lemlim a Johnem Opitzem u 3 pacientů s mikrocefalií, charakteristickými dermatoglyfickými rysy, hypospadií, opožděním vývoje a těžkou poruchou příjmu potravy.

Spektrum malformací u pacientů se SLO syndromem je poměrně rozmanité: mikrocefalie, rozštěp patra, syndaktylie 2/3 prstu, polydaktylie, obličejové malformace, anomálie srdce a ledvin, nejednoznačně diferencovaný genitál u chlapců.
Klinické projevy jsou značně variabilní od středně těžkého dysmorfismu s mírnou mentální retardací (SLO I) až po intrauterinní úmrtí (popřípadě úmrtí v ranném věku) plodu se SLO syndromem (SLO II).

Mnoho postižených dětí umírá v prvním roce života díky neprospívání a poruchám příjmu potravy, na infekci, ale mnoho postižených se dožívá dospělosti.
V osmdesátých letech 20. století bylo zjištěno, že u pacientů se SLO syndromem je 1000x zvýšená hladina 7-dehydrocholesterolu v plazmě. Tento nález ukazoval na deficit 7-dehydrocholesterol reduktázy (∆7-sterol reduktázy) při biosyntéze cholesterolu (Kandutsch-Russelova dráha biosyntézy cholesterolu), která je kódována genem DHCR7.

DHCR7 gen je lokalizován na 11. chromosomu (11q12-13). Má velikost zhruba 14 kb a je tvořen 9 exony a 8 introny. První dva exony jsou nekódující, start kodon je lokalizován v exonu 3. Exon 9 je největší o obsahuje stop kodon.

Enzym 7-dehydrocholesterol reduktáza (∆7-sterol reduktáza) katalyzuje redukci C7-C8 dvojité vazby 7 – dehydrocholesterolu a vzniká cholesterol. Snížená aktivita/ nedostatek enzymu vede k hromadění prekurzorů sterolu – 7 dehydrocholesterolu a 8 dehydrocholesterolu, které jsou pro embryo toxické. Dále hraje cholesterol významnou roli při embryogenezi, kdy zodpovídá za distribuci hedgehog proteinů ve vyvíjejícím se embryu a kdy je nutný ke stavbě buněčných membrán a jako prekurzor steroidních hormonů.
Smith-Lemli-Opitz syndrom je prevalentní v populacích střední Evropy, v České republice je uváděna incidence na 1/10 000. Frekvence nosičů může být až 2%.
Mutační spektrum DHCR7 genu u pacientů v České republice se liší od mutačních spekter zjištěných u populací západní a střední Evropy, USA a Kanady.

Materiál pro vyšetření:

• 5 ml venózní krve odebrané do EDTA (krev s heparinem nelze použít!), označené minimálně dvěma identifikačními symboly: jménem a datem narození (nebo rodným číslem pacienta)
• 15ml plodové vody do sterilní nádobky označené štítkem se jménem a datem narození pacienta
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená alespoň 2 identifikačními symboly (jménem + rodným číslem pacienta)
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi a informovaný souhlas pacienta s požadovaným vyšetřením.

Transport vzorků do laboratoře – zajištěn svozem CGB laboratoře a.s.

Metoda detekce mutací v DHCR7 genu:

V naší laboratoři vyšetřujeme 10 mutací: W151X a V326L jsou prevalentní mutace v české populaci; dále L109P, L157P, R352Q, C380Y, R404C, G410S, R446Q a sestřihovou mutaci c.964-1G>C (IVS8-1G>C). Mutace detekujeme pomocí polymerázové řetězové reakce s následnou RFLP (restrikční analýzou fragmentů) jednotlivých mutací. Dále využíváme sekvenace nejdelšího exonu 9 a detekce mutací V326L, R352Q, C380Y, R404C, G410S, Y432C, R446Q a sestřihové mutace c.964-1G>C (IVS8-1G>C).

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 7-10 pracovních dnů po převzetí vzorku v případě periferní krve, v případě plodové vody je nutné zohlednit dobu kultivace, která se pohybuje od 10-20 dní
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku periferní krve, v případě plodové vody je nutné zohlednit dobu kultivace
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Gastrointestinální stromální nádory (GISTs) patří mezi nejčastější mezenchymální nádory trávicího traktu. Za jeden z klíčových dějů v onkogenezi GIST se považují aktivační mutace genů kódujících receptorové tyrozinkinázy KIT a PDGFRA. Přibližně 70-85% GISTů nese mutaci KIT genu (OMIM*164920) a 5-10% mutaci v genu PDGFRA (OMIM*173490). Studie potvrdily přítomnost mutací PDGFRA v ~30-60% KIT-imunonegativních a/nebo KIT ,,wild type'' tumorů splňujících histologická kritéria GIST. Gen PDGFRA (platelet derived growth factor receptor α) je lokalizován na dlouhém raménku 4. chromosomu, kóduje alfa podjednotku receptoru tyrozin kinázy PDGF, která náleží do podskupiny III protein tyrozin kinázové rodiny. Nejvíce mutací je lokalizováno v exonech 12, 14 a 18 PDGFRA genu. Nejčastější mutací v genu PDGFRA je substituce D842V v exonu 18 (~60%) spojená s rezistencí na terapii imatinib mesylátem (Glivec). V některých studiích byla prokázána spojitost s predominantní žaludeční lokalizací, epiteloidní morfologií PDGFRA mutovaných GISTů. Rovněž byla popsána u ~7% pacientů bez mutace KIT a PDGFRA (tzv. wt GIST) přítomnost mutace V600E v BRAF genu. Molekulárně genetické vyšetření genů PDGFRA má význam nejen diferenciálně diagnostický, ale i prediktivní.

Materiál pro vyšetření:

• nativní, zamražená, případně fixovaná nádorová tkáň o velikosti min. 3x3x3mm, uložená do sterilní nádoby (mikrozkumavky), transport do laboratoře v den odběru (případně do 24 hod.)
• parafínový bloček s největším zastoupením nádorové tkáně a s přesným označením lokalizace nádoru v daném bločku
• vyizolovaná DNA rozpuštěná ve vodě nebo TE pufru, řádně označená 2 identifikačními symboly - jménem a rodným číslem pacienta
• přiložená žádanka specifikující druh požadovaného vyšetření a obsahující nezbytné údaje o pacientovi

Metoda detekce:

• přímá sekvenace exonů 12, 14 a 18 PDGFRA genu se provádí pomocí BigDye terminator v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems).

Transport vzorků do laboratoře

Zajištěn svozem CGB laboratoře a.s. - Kontakty dopravního oddělení CGB laboratoře.

Délka trvání vyšetření a způsob vydání závěrečné zprávy:

• požadované vyšetření a vydání závěrečné zprávy je realizováno do 1-2 týdnů po převzetí vzorku
• v případě vzorku s označením STATIM je vyšetření a vydání závěrečné zprávy provedeno do 2-3 pracovních dnů po převzetí vzorku
• závěrečné zprávy o výsledku jsou z laboratoře zasílány písemně pouze zadavateli vyšetření – lékaři, oprávněnému indikovat vyšetření.

Obr. Mutace genu PDGFRA. Substituce D842V v exonu 18 (c.2525A>T) PDGFRA genu.